Шпаргалки для студентов

готовимся к сессии

  • Увеличить размер шрифта
  • Размер шрифта по умолчанию
  • Уменьшить размер шрифта

Шпаргалки: культура тканей и клеток растений - Получение изолированных протопластов

 

 


Получение
 изолированных протопластов (ИП)

Впервые протопласты выделил механически Дж. Клеркер из эпидермиса листа телореза (1892). Механический способ выделения протопластов включает плазмолиз, в результате которого протопласты отходят от клеточных стенок, с последующим разрезанием клеточных оболочек, после чего происходит выход протопластов в среду. Но при этом нарушается связь цитоплазматических структур с плазмалеммой и, возможно, происходит частичная разборка поверх­ностной мембраны ИП, что является существенным недостатком метода.

Ограничения метода: 1) небольшой выход протопластов; 2) выделение их только из тканей, где происходит экстенсивный плазмолиз; 3) трудность полу­чения протопластов из меристематической или зрелой ткани; 4) длительность и трудоемкость метода.

В настоящее время применяют энзиматический способ выделения про­топластов. Его сущность заключается в том, что для удаления клеточных сте­нок используют ферментные препараты. Этот способ имеет ряд преимуществ перед предыдущим: 1) возможность выделения больших количеств протопла­стов; 2) отсутствие сильного осмотического сжатия ИГ1; 3) сохранение интактности ИП; 4) быстрота.

В энзиматическом способе выделения протопластов используют препа­раты трех типов - целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Обработка расти­тельных клеток чаще проводится комбинацией ферментов; соотношение их варьирует в зависимости от вида растения, типа ткани, функциональных осо­бенностей, возраста, наличия вторичной клеточной стенки и т. д.

Приведем примеры используемых ферментов и осмотиков при выделе­нии протопластов из разных объектов:

1) из плодов пасленовых - пектиназа;

2) из мезофилла листа табака: целлюлаза - 2,5 %; пектиназа - 0,25 %, маннит - 0,4 М;

3) из мезофилла листьев и суспензионных культур картофеля: ксиланаза — 2 %, маннит - 0,3-0,4 М;

4) из каллусных тканей пшеницы: целлюлаза 1000 - 2 %, пектатлиаза 0,3 %,СаС12 - 0,25 М;

5) из гииокотилей рапса: целлюлаза - 0,5 %, мацерозим - 0,05 %, маннит 0,4 М.

Рассмотрим технику выделения протопластов, предложенную И. Такебе для листьев Nicotiana tabacum. От растения в возрасте 60-80 суток берут пол­ностью сформировавшийся лист, стерилизуют несколько секунд в 70%-м эта­ноле и 15-20 мин в 10%-м гипохлорите кальция, после чего несколько раз про­мывают в стерильной дистиллированной воде. С подвядшего листа пинцетом снимают нижний эпидермис, разрезают скальпелем на участки площадью око­ло 4 см2, после чего кусочки ткани обрабатывают сначала пектиназой (вызы­вающей мацерацию ткани), затем целлюлазой (способствующей разрушению клеточной стенки).

Ферменты можно использовать одновременно, но не во всех случаях. Часто применяют совмещенные препараты, например ксиланазу, в состав которой вхо­дят: эндоксиланаза + ксилозидаза + (3-1,4-эндоглюканаза + целлобиаза + эндополигалактуроназа + пектинэстераза + протеаза (в концентрации 2-5 %).

Изолированные протопласты

Важным фактором для жизнеспособности ИП является подбор осмоти­ческого стабилизатора, в качестве которого выступают сахара (маннит, сор­бит, ксилоза, сахароза, глюкоза) или ионные осмотики (СаСЬ, Na2HP04, КС1). Концентрация стабилизатора обычно около 0,3-0,8 моль/л: осмотик должен быть слегка гипертоничным, чтобы протопласты были немного плазмолизиро- ваны (при этом тормозятся метаболизм и регенерация клеточной стенки). Так же эмпирически подбирают и другие условия среды: интенсивность света (ча­ще используют темноту или слабый свет), рН (обычно 5,4-6,2), температуру, концентрации солей (Са2+, Mg2+, которые необходимы для стабилизации мебранной системы клетки).

После обработки ферментными препаратами протопласты нужно очи­щать от остатков неразрушенной ткани, осколков клеток, отмыть от ферментов. Для этого известны два способа: фильтрация с центрифугированием и флота­ция.

В первом варианте смесь пропускают через фильтр с порами около 40 мкм, при этом на нем остаются неразрушенные клетки и их крупные оскол­ки. Далее центрифугируют таким образом, чтобы оседали ИГ1, а мелкие оскол­ки клеток оставались в супернатанте. При повторной промывке протопласты отмываются от ферментов и переносят в среду культивирования. Этот метод довольно грубый, так как разрушает хрупкие протопласты.

Флотация основана на том, что ИП имеют более низкую плотность, чем куски клеток, клеточных стенок и органеллы. К фракции протопластов добав­ляют раствор маннита (0,3-0,6 моль/л) или сорбита, затем проводят мягкое центрифугирование (40-350 g), после чего ИГ1 остаются в растворе, а осколки оседают.

Хорошим выходом считается изолирование (1- 5)106 жизнеспособных протопластов из 1 г свежей массы ткани растения или культивируемых клеток. Качество суспензии ИП оценивается по проценту жизнеспособных протопла­стов и по степени очистки фракции от клеток с неразрушенной стенкой, остат­ков клеток, органелл и других включений.

Для того чтобы получить жизнеспособные ИП, нужно аккуратно подби­рать параметры выделения (ферменты, рН, осмотик, температуру), а также учи­тывать физиологическое состояние растительного материала, возраст, условия выращивания. Обычно факторы, активирующие рост растения, будут увеличи­вать вероятность получения жизнеспособных протопластов. Жизнеспособность их можно повысить, если кусочки листьев без эпидермиса предварительно ин­кубировать 1,5-2,0 дня на среде для клеточных культур.

При получении протопластов из клеточных и суспензионных культур

лучше использовать позднюю стадию логарифмической фазы роста. В этот пе­риод клеточные стенки легче поддаются энзиматическому разрушению, а ИП наиболее жизнеспособны. Увеличение в среде ауксина и снижение сахарозы за 1 сутки до выделения протопластов также активирует их выход.

Однако необходимо иметь в виду, что при использовании культуры кле­ток в качестве исходного материала при выделении протопластов всегда будет наблюдаться нестабильность числа хромосом: образуется смесь эуплоидных и анеуплоидных клеток (эуплоидные — клетки с числом хромосом, кратным X; анеуплоидные - с числом хромосом, уклоняющимся от X и от чисел, кратных X). Последние неспособны к нормальному морфогенезу, поэтому снижается частота регенерации растений из изолированных протопластов.

Для стабилизации хромосом при использовании клеточных культур в ка­честве источника ИП необходимо использовать некоторые особенности исход­ных объектов и условий культивирования: 1) выбор экспланта для культуры клеток: в тканях листа и молодых побегов диплоидных клеток больше, чем в сердцевидных клетках; 2) концентрацию регулятора роста: высокие концен­трации кинстина способствуют возникновению полиплоидии; 3) поддержание условий, благоприятных для доминирования диплоидной популяции.