Шпаргалки для студентов

готовимся к сессии

  • Увеличить размер шрифта
  • Размер шрифта по умолчанию
  • Уменьшить размер шрифта

Шпаргалки: культура тканей и клеток растений - Способы культивирования протопластов

 

 


Способы культивирования протопластов

В настоящее время используют два основных метода культивирования ИП: метод жидких капель и метод платирования.

По первому методу капельную суспензию протопластов помещают в жидкой среде на пластиковые чашки. При этом обеспечиваются хороший об­мен газами через воздушную фазу, удаление в раствор (диффузия) экскретируемых продуктов, легкость добавления свежего питательного раствора. Не­достатки метода: ИП агрегируются в центре капли, в результате образуя боль­шое количество токсинов; нельзя получить индивидуальную колонию прото­пластов.

Разновидностью метода жидких капель является культивирование еди­ничных протопластов в малом объеме (до 1 мкл).

Второй метод включает помещение суспензии ИП в жидкой питательной среде в пластиковые чашки Петри. Затем туда добавляют такой же объем этой среды с 1%-м агаром (температура агаризованного раствора не более 40-^5 °С). После затвердевания агара чашки Петри заклеивают парафилмом или лейко­пластырем и переворачивают (температура при этом около 28 °С). В результа­те протопласты фиксируются в одном положении и физиологически отделены один от другого. Положительные стороны метода платирования - на одном протопласте можно наблюдать последовательность его развития, в том числе формирование клеточной стенки, деление клеток и т. д., нет агрегации ИП и накопления токсинов. Недостатки метода: возможно повреждение протопла­стов при смешении с теплым агаром.

Вариант метода платирования — использование «кормящего слоя» или ткани-«няньки». Часто применяют метод совместных культур, когда объеди­няют ИГ1 с быстрым ростом и протопласты с трудным культивированием. При этом вещества, выделяемые быстрорастущими протопластами, активируют рост другой партии.

Питательные среды для культивирования ИП - такие же, как для культу­ры клеток: МС, В5, Као-Михайлюка. Однако необходимо создавать опреде­ленную буферную емкость среды, для чего применяют сопряженные пары со­лей - химически или физиологически кислые и щелочные соли, содержащие азот и фосфор. Например, в среде МС используют физиологически щелочную соль KNO3 и физиологически кислую соль NH4NO3, а также химически кислую соль КН2РО4 (рН среды поддерживается в пределах 5,6-5,8). Питательные сре­ды содержат также Fe-ЭДТА, сахарозу, витамины и регуляторы роста. Для стимуляции образования клеточной стенки добавляют углеводы, входящие в состав клеточной стенки (ксилозу, рибозу и др.). Для индукции деления ИП до­бавляют регуляторы роста: 2,4-Д, нафтилуксусную кислоту (ПУК), БАП, кинетин.

Температура культивирования протопластов зависит от вида растения, причем требования очень жесткие: ИГ1 не выдерживают даже незначительного отклонения от оптимальной температуры. Интенсивность света также варьиру­ет в зависимости от вида, но в общем высокая интенсивность губительно дей­ствует на свежевыделенные протопласты.

При низкой плотности засева протопласты не делятся, а при высокой на рост колонии влияют выделяемые продукты обмена. Считается, что оптималь­ная плотность ИП в культуре - от 3-103 до 105 на 1 мл среды.

В культуре протопластов клеточные стенки образуются сразу после уда­ления раствора фермента (процесс саморегулирусмый). Сложнее идет деление клеток и образование растения.

Регенерация растений может происходить либо через эмбриогенез, либо через образование каллуса с индукцией морфогенеза. Рассмотрим примеры первого пути. Протопласты из суспензионной культуры моркови на среде с 2,4-Д через 8-10 суток образуют группы клеток, затем на них формируются эмбриоиды, из которых можно получить проростки, и при переносе на среду без 2,4-Д образуются растения.

ИГ1 из клеток корня моркови, помещенные на среду с 1 %-м кокосовым молоком, содержащую НУК или 2,4-Д, формируют группы клеток; перенос их на среду с гидролизатом казеина, кокосовым молоком или кинетином приводит к образованию каллуса (через 4-8 недель) с последующей дифференциацией на нем эмбриоидов.

Можно получить целые растения из протопластов не только через эм­бриогенез, но и путем последовательного формирования побегов и корневой системы. Рассмотрим регенерацию растений из протопластов мезофилла листа табака. После помещения ИП на среду МС, содержащую 3 мг/л НУК и 1 мг/л БАП, через 3 недели образуются колонии; их переносят на среду Сакристан-Мельхерса, где формируется каллус, а спустя 3 недели - дифференциро­ванные побеги, которые помещают в почву для образования растения.



 

Купить стальные двери форпост torexcsm.ru