Шпаргалки для студентов

готовимся к сессии

  • Увеличить размер шрифта
  • Размер шрифта по умолчанию
  • Уменьшить размер шрифта

Шпаргалки: культура тканей и клеток растений - Дедифференцировка и каллусогенсз

 

 


Дедифференцировка и каллусогенсз

Дедифференцировка клеток экспланта и каллусогенез (образование каллусной ткани) зависят, во-первых, от генотипа исходного растения, во-вторых, от внешних условий (особенно — регуляторов роста), а в-третьих, от эпигене­тических особенностей тканей экспланта. Клетки запасающей паренхимы, корня, стебля, мезофилла листа и других тканей при помещении на питатель­ную среду должны дедифференцировагься, т. е. вернуться к состоянию деля­щейся клетки. Если мы берем эксплант с набором разных тканей, то клетки их будут различно дифференцированы. Например, фрагмент стебля содержит клетки: эпидермальные, первичной коровой паренхимы, камбия, сосудистой системы, сердцевинной паренхимы. В разных условиях культивирования и в зависимости от различий в физиологическом состоянии растения можно на­блюдать пролиферацию преимущественно клеток либо камбия, либо коры, ли­бо сердцевинной паренхимы. Поэтому культивируемые ткани гетерогенны уже по своему происхождению: слишком разные ткани составляют первичный экс­плант и участвуют в образовании каллуса. В процессе культивирования гетеро­генность каллусной (а также суспензионной) культуры не исчезает, а порой даже усиливается. Для растительных культур in vitro часто характерно явление полиплоидизации и анеуплоидизации.

В число возможных причин цитогенетической изменчивости входят:

1) нарушение коррелятивных связей при выделении первичного эксплан­та из растения;

2) действие компонентов питательной среды;

3) влияние продуктов метаболизма, накапливающихся в среде при пе­риодическом режиме культивирования;

4) гетерогенность исходного материала и селекция клеток определенного типа.

Для многих культур показана корреляция между возрастанием цитогене­тической вариабельности в процессе культивирования и снижением морфоген- ного потенциала.

 

Важным фактором для протекания дедифференцировки и каллусогенеза является механическое повреждение ткани экспланта. В клетках экспланта, со­стоящего из дифференцированных неделящихся клеток, в начале культивиро­вания наблюдаются изменения в метаболизме, связанные с травматическими синтезами, дедифференцировкой и подготовкой к делению. Между этими про­цессами имеется взаимосвязь, но механизм ее точно неизвестен. Предполагают, что травма приводит к высвобождению из клеток БАВ — элиситоров клеточ­ных делений, которые отличаются от известных стимуляторов роста гормо­нальной природы. В их роли могут выступать, например, продукты разрушения полисахаридов клеточной стенки. Действием элиситоров можно объяснить и быструю дедифференцировку специализированной клетки. Перестройка клеток экспланта, предшествующая каллусогснезу, происходит следующим образом. В первую очередь идет метаболизация запасных веществ — линидов, крахмала, белков. У фотосингезирующих клеток разрушается хлорофилл и перестраива­ется пластидный аппарат - возрастает количество амилопластов. В клетке раз­рушается аппарат Гольджи, перестраиваются ЭПР и элементы цитоскелета.

В готовящейся к делению клетке стимулируется синтез всех форм РНК, начинается репликация ядерной ДНК, исчезают тканеспецифичные бел­ки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и для каллусной ткани. Это свидетельствует об изменениях в активности генов и белкового аппарата клеток при дедифференцировке. Синтез белков в эксплантах начинается через несколько часов после их переноса в условия in vitro. Од­нако на этой первой стадии, связанной с механическим повреждением, синтез белка вскоре останавливается. Возможно, здесь действуют природные гормоны растения, которые транспортируются, но длительно не синтезируются. Добав­ление к среде экзогенных гормонов (ауксина и цитокинина) запускает каллусогенез.


Образование каллуса в разных тканях

Каллус может образовываться не только на раневой поверхности экс­планта, но и в результате пролиферации внутренних тканей. В этом случае он разрывает слой ткани и выходит на поверхность. Примером является каллусо- генез в культуре изолированного пыльника: гаплоидная микроспора, образо­вавшаяся в ходе мейоза при культивировании пыльника in vitro, уклоняется от нормального микроснорогенеза, повторно симметрично делится, дедифферен- Цируется и превращается в каллусную.

Интересно проходят дедифференцировка и каллусогенез в апикальной меристеме стебля (ткани, состоящей из делящихся недифференцированных клеток): сразу после переноса на питательную среду прекращаются митозы, характерные для ткани in vivo, клетки дедифференцируются, увеличиваются в объеме, теряют форму, характерную для меристем, изменяется структура ядра и цитоплазмы, и только после этого вновь начинается деление клеток, приво­дящее к образованию каллусной ткани.

В настоящее время возможно получить длительную пересадочную кал­лусную культуру из любых живых тканей интактного растения. Каллусогенез in vitro свойственен, кроме покрытосеменных, также голосеменным, папорот­никам, мхам и печеночникам. В культуре in vitro различные клетки переходят к дедифференцировке, теряют характерную для них структурную организацию и начинают делиться, образуя гетерогенный первичный каллус, который через

4—6 недель необходимо еубкультивировать (переносить на свежую питатель­ную среду). Масса транспланта - 60-100 мг ткани на 20-40 мл питательной среды. В ходе субкультивирования формируется штамм, имеющий индивиду­альные генетические и физиологические особенности.

Требования асептики при получении культуры in vitro

Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты тканей (первичные экспланты) помещают на искусственную питательную среду в про­бирки, колбы или чашки Петри. Это требует полной асептики, так как грибная и/или бактериальная инфекция ингибируют рост клеток и приводят культуру к гибели. Поэтому эксплант поверхностно стерилизуют (от 1 до 30 мин в зависи­мости от его типа) растворами, содержащими активный хлор или ртуть (гипохлорит кальция или натрия, сулема, диацид), к которым добавляют детергенты (для лучшего смачивания поверхности экспланта). В табл. 1 представлены ус­ловия стерилизации эксплантов разных объектов.

После инкубации в стерилизующем растворе экспланты промывают тре­мя порциями стерильной воды по 10 мин в каждой.

Питательную среду стерилизуют в автоклаве при 70—80 кПа в течение 15-30 мин (в зависимости от объема среды) или фильтруют через ультра­фильтры. Посуду, инструменты и материалы, необходимые для работы, также стерилизуют в автоклаве в течение 1 ч при 200 кПа, или сухим жаром в стерилизационных шкафах (при 160 °С 2 ч или 1 ч при 180 °С). Работу с культурами проводят в боксах микробиологического типа, облучаемых перед работой ультрафиолетом, или в ламинар-боксах, где асептика достигается постоянной подачей стерильного воздуха в рабочий объем камеры.



 

Изготовление памятников Минск тут;Купить свадебный альбом для фотографий www.studio5plus.ru