Шпаргалки для студентов

готовимся к сессии

  • Увеличить размер шрифта
  • Размер шрифта по умолчанию
  • Уменьшить размер шрифта

Шпаргалки: культура тканей и клеток растений - Процессы дифференцировки в культуре in vitro

 

 


Процессы дифференцировки в культуре in vi
tro

Каллусные клетки способны дать начало различным процессам дифференцировки. Наиболее простой ее вид - появление в каллусной ткани диффе­ренцированных клеток, имеющих специфическое морфологическое строение и несущих особые функции, например эпибластов клеток, депонирующих за­пасные питательные вещества и/или вторичные метаболиты. Более сложные виды - гисто-, органо- и эмбриогенез. Рассмотрим их подробнее.

Гистологическая дифференцировка каллусных клеток (гистогенез) ~ об­разование в каллусе различных тканей: млечников, волокон, трихом, но чаще всего - трахеидо- и флоэмоподобных элементов. Превращение каллусной тка­ни в сосудистый элемент определяют прежде всего гормональные факторы (в основном ауксины). Для гистогенеза необходима сахароза (но не другие саха­ра): внесение в среду 10 мг/л ауксина с высокой концентрацией сахарозы (8 %) приводило к дифференциации каллусных клеток во флоэмные элементы, а с низкой (2 %) - в ксилемные элементы.

in vitro

Органогенез в культуре in vitro - дифференциация каллусных клеток в це­лые органы: превращение их в апексы побегов или корней, флоральные элемен­ты. Способность к органогенезу определяется по-разному у растений различных семейств, видов, сортов. Перечень семейств цветковых растений, расположен­ных по степени снижения способности к органогенезу, выглядит следующим об­разом: пасленовые > крестоцветные > зонтичные > сложноцветные > бобовые> злаки.

Индуктором органогенеза является количественное соотношение экзо­генных регуляторов роста ауксинового и цитокининового типа действия в пи­тательной среде. Превышение концентрации цитокининов над ауксинами при­водит к стеблевому морфогенезу, обратное соотношение вызывает образование корней, а примерно равное соотношение стимулирует неорганизованный рост каллусной ткани. В ходе многочисленных экспериментов было показано, что частота морфогенеза зависит от генотипа исходного растения, эпигенетической характеристики клеток первичного экснланта и условий выращивания. Поэто­му соотношение ауксинов и цитокининов в питательной среде для индукции органогенеза для каждого вида подбирают эмпирически.

Исследования показали, что если в среде присутствует только ауксин, то клетки, пройдя этап активации синтеза РНК и начало синтеза ДНК, не перехо­дят к делению, а вместо этого начинают расти растяжением. Если же в среду добавлен только цитокинин, в клетках не происходит активация синтеза ДНК и РНК и также не начинается деление. Таким образом, в клетке существует двой­ной гормональный контроль деления: ауксин подготавливает клетку к делению, которое затем запускается цитокинином. Ауксин необходим для перехода спе­циализированной клетки из фазы Go в S-фазу клеточного цикла, цитокинин — для завершения последующих фаз G2, М и цитокинеза (Р. Г. Бутенко, 1975, 1987).

Процесс органогенеза in vitro зависит также от трофических факторов (азотсодержащих солей, аминокислот, особенно тирозина), действия стрессов (NaCl, пониженных положительных температур и др.), стимуляторов, присут­ствия сигнальных белков и белков-акцепторов. Очень интересно происходит образование флоральных побегов в культуре in vitro, когда каллусные клетки дифференцируются в зачатки репродуктивных органов. Показано, что каллусы из эксплантов верхних междоузлий табака сохраняют способность образовы­вать флоральные побеги даже после нескольких субкультивирований. У раз­личных видов крокусов обнаружен специфический органогенез in vitro - обра­зование рыльцеобразных структур, особенно при культивировании завязи в ка­честве экспланта (В. В. Чуб, 1994).

 

Соматический эмбриогенез - образование в каллусной или суспензион­ной культуре эмбриоидов, то есть зачатков интактного растения, способных развиваться во взрослое растение. С точки зрения биотехнологии, он имеет много преимуществ перед органогенезом, так как регенерант на основе сома­тического зародыша полностью сформирован, а побеги надо еще укоренять.

Формирование эмбриоидов (зародышей) из соматических клеток в усло­виях in vitro впервые наблюдали в суспензионной культуре клеток моркови Ф. Стюард с сотрудниками (1958). Такие зародыши при переносе на соответст­вующую питательную среду развивались в целые растения. Этот процесс на­глядно демонстрирует тотипотентность растительных клеток.

Соматический эмбриогенез включает стадии развития, аналогичные ста-

дням при зиготическом эмбриогенезе: глобулы, сердца, торпеды, сформиро­ванного зародыша молодого проростка.

В некоторых случаях эмбриоиды образуются непосредственно из клеток ткани, введенной в культуру, так называемый прямой эмбриогенез. В других случаях происходит непрямой эмбриогенез: вначале формируется каллус, а уже из него развиваются зародыши.

Эмбриоиды образуются из одиночных клеток, расположенных в основ­ном на поверхности каллуса. Окружающие вакуолизированные клетки могут выполнять ло отношению к эмбриогенным клеткам функцию ткани-«няньки».

В суспензионных культурах выделяют два основных этапа: сначала из одиночных клеток в результате многократных делений формируются компакт­ные проэмбриогенные комплексы, затем из такого комплекса развивается один или несколько эмбриоидов. Клетки, дающие начало эмбриоидам, отличаются более плотной цитоплазмой, относительно большим ядром с увеличенным яд­рышком, в них присутствуют крупные крахмальные гранулы и мелкие вакуоли. Эти клетки метаболически активны, богаты белками и РНК.

Потребность в гормонах на каждом из этапов эмбриогенеза различна. Проэмбриогенные комплексы образуются в присутствии ауксина, однако пере­ход к формированию эмбриоидов данный гормон ингибирует. Поэтому на вто­ром этапе соматического эмбриогенеза ауксин или исключают из среды, или используют его в очень низких концентрациях.

Предполагают, что прямой эмбриогенез в культуре происходит из клеток, которые уже детерминированы для эмбриогенного развития перед экспланта­цией, то есть являются преэмбриогенно детерминированными. Поэтому чтобы произошла экспрессия эмбриогенеза, требуются только благоприятные усло­вия. Непрямой эмбриогенез идет путем редетерминации (повторной детерми­нации) дифференцированных клеток, пролиферации каллуса и развития эм- бриогенно детерминированного состояния. Тогда необходимы гормоны как для индукции деления клеток, так и для детерминации эмбриогенного состояния.

Клетки молодых проростков, особенно из эпидермиса гипокотиля, пред­ставляют собой наиболее удобный материал для получения соматических эм­бриоидов. Эта способность клеток уменьшается по мере удлинения срока от начала культивирования. Например, у моркови эмбриоиды начинают образо­вываться через 4-6 недель после получения каллуса, оптимальный возраст культуры для индукции соматического эмбриогенеза - 15-20 недель; 30-40 недельная культура часто теряет свой эмбриогенный потенциал (И. П. Ермаков и др., 1994).

Наиболее ранняя фаза детерминации клетки на эмбриогенный путь раз­вития - приобретение его свойств полярности, или аксилярности. Она поддер­живается несколькими механизмами, которые включают активный базипеталь- ный транспорт эндогенного ауксина, градиент БЭП, градиенты ионов Са2+. Важное значение имеют перестройка цитоскелета морфогенных клеток, акти­вация протеинкиназы Р34, ингибирование фосфорилирования и окончания де­

ления, переход клеток в состояние покоя. В незрелых зародышах изменяется содержание эндогенных фитогормонов.

В регуляции соматического эмбриогенеза очень большую роль играют свет (возможно, посредством активации фитохрома), особенно его спектраль­ный состав, а также экспрессия сигнальных белков. Индуктором эмбриогенеза также может быть слабый постоянный электрический ток. Интересно, что в не­которых ситуациях можно наблюдать органо- и эмбриогенез одновременно. Например, первичный каллус на срезе черешка листа моркови в разных участ­ках давал начало как моно-, так и биполярным органам. В зоне, близкой к пс- рициклу, каллусы дифференцировались как зачатки корней; затем в зоне коро­вой паренхимы каллусы дифференцировались как зачатки побегов. Значитель­но позже в субэпидермальной зоне возникали биполярные эмбриоиды. Воз­можно, такой морфогенез обусловлен эпигенетическим влиянием экенланта


Поверхностное культивирование каллусных клеток

Культура каллусных тканей выращивается поверхностным способом — либо на полутвердой агаризованной среде, либо на мостиках из фильтроваль­ной бумаги или дисках из пенополиуретана, полупогруженных в жидкую пита­тельную среду.

Каллусная ткань представляет собой аморфную массу тонкостенных па- ренхимных клеток, не имеющую строгой анатомической структуры. Цвет мо­жет быть белый, желтоватый, зеленый, красноватый, бурый, пигментирован­ный полностью или участками в связи с присутствием хлорофилла, антоцианов и других пигментов. В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают: 1) рыхлые, сильно обводненные, легко распадаются на отдельные клетки; 2) средней плотности, с выраженными меристематиче- скими очагами; 3) плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов. В длительной пересадочной культуре на средах с ауксинами каллусные ткани те­ряют пигментацию и становятся более рыхлыми.

В цикле выращивания каллусные культуры после ряда делений проходят обычный для клетки растения онтогенез, т. е. приступают к росту растяжением, затем дифференцируются как зрелые каллусные клетки, в конце - деградиру­ют.

Модельная кривая ростового цикла при периодическом выращивании каллусных тканей имеет S-образную форму. Субкультивирование рекомендует­ся проводить, используя трансплант из фаз замедления роста или ранней ста­ционарной предыдущего цикла выращивания.

Каллусные ткани применяют для сохранения в растущем состоянии кол­лекций разных штаммов, линий, мутантов, регенерации растений, для получе­ния суспензионных культур.