Шпаргалки для студентов

готовимся к сессии

  • Увеличить размер шрифта
  • Размер шрифта по умолчанию
  • Уменьшить размер шрифта

Шпаргалки: культура тканей и клеток растений - Глубинное культивирование клеток высших растений

 

 


Глубинное культивирование клеток высших растений

Культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой питательной среде, называют суспензионными культурами. Отдельные клетки или небольшие их группы должны выращиваться во взвешенном состоянии в специальной аппа­ратуре, которая обеспечивает их аэрацию и перемешивание.

Обычно клеточную суспензию получают на основе культуры каллусной ткани. Успех работы во многом зависит от того, насколько удачно была выбра­на или подготовлена исходная линия. Она должна быть рыхлой, легко распа­дающейся на небольшие клеточные агрегаты и клетки. Если каллусная ткань плотная, то ее в течение нескольких пассажей культивируют на питательной среде с повышенной концентрацией ауксинов (особенно 2,4-Д) и низкой кон­центрацией цитокининов, часто исключая из среды соли Са2+ или обрабатывая трансплант пектиназой.

Для получения суспензионной культуры клеток берется наиболее жизне­способная (пролиферирующая) каллусная ткань, которую помещают в колбу с жидкой питательной средой. Питательная среда берется такого же состава, как и для роста каллусной ткани (за исключением агара), но иногда с увеличением количества ауксинов и/или уменьшением количества цитокининов. Инициация суспензионной культуры требует примерно 2—3 г свежей массы каллусной тка­ни на 60-100 мл жидкой питательной среды. Если каллусная ткань недостаточ­но рыхлая, ее разделяют на кусочки размером 3-4 мм. Колбу с культурой ста­вят на платформу качалки (скорость перемешивания 100-150 об/мин) или ис­пользуют установку роллерного типа (скорость вращения до 20 об/мин).

Важно отметить, что суспензионную культуру можно получить прямо из фрагмента органа растения (диски запасающей паренхимы корнеплодов мор­кови, петрушки, клубней картофеля и др.), однако такой путь более трудный и длительный. Клетки экспланта должны образовать первичный каллус, и только после этого калл у сны е клетки, смытые с поверхности в среду и размножившие­ся в ней, дадут начало линии, способной расти в суспензии.

Через 2-3 недели культивирования получают первичную суспензию рас­тительных клеток; это результат трех процессов: 1) распадения части каллус­ной ткани на клетки и клеточные агрегаты в момент внесения в жидкую пита­тельную среду и дальнейшего их деления и роста; 2) отделения клеток и кле­точных агрегатов в период культивирования и дальнейшего их деления и роста; 3) распадения разрастающихся клеточных агрегатов на более мелкие агрегаты и клетки.

При первых субкультивированиях необходимо избавиться от крупных клеточных агрегатов. Операцию проводят в асептических условиях. Первич­ную суспензионную культуру переливают в цилиндр, при этом крупные кле­точные агрегаты оседают на дно, мелкие агрегаты и отдельные клетки остаются в толще раствора (для субкультивирования берут верхнюю фракцию). Опера­цию следует проводить и при последующих субкультивированиях, до приобре­тения клеточной суспензии желаемых характеристик. Таковыми являются: 1) высокая степень дезагрегации (5-10 клеток в группе); 2) морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или овальная форма, плотная цитоплазма); 3) отсутствие трахеидоподобных элементов.

Чтобы избавиться от кусков каллусной ткани (остатков экспланта) и очень крупных клеточных агрегатов, часто первичную суспензию перед суб­культивированием фильтруют через 1-2 слоя марли, нейлоновые или металли­ческие сита. Фильтрование рекомендуется проводить и в нескольких после­дующих субкультивированиях до получения клеточной суспензии нужного ка­чества. Следует иметь в виду, что степень агрегированности суспензии зависит не только от характеристик исходной линии, но и от условий культивирования. При субкультивировании необходимо постоянно поддерживать: 1) период суб­культивирования; 2) режим перемешивания; 3) режим аэрации; 4) количество и физиологическое состояние инокулюма.

Для разных культур существует минимальный объем инокулюма (переса­дочной культуры), то есть варьирует его критическая концентрация, обеспечи­вающая клеточное размножения в субкультуре. Это зависит от того, что только начиная с определенного числа клеток в единице объема культуральной среды появляются необходимые свойства так называемого кондиционирующего фак­тора, или фактора кондиционирования. Механизм его действия не выяснен, однако известно, что он имеет химическую природу, термостабилен, включает низкомолекулярные вещества и не заменяется фитогормонами.

Подбор оптимального количества инокулюма и продолжительность суб­культивирования являются одним из способов отбора быстрорастущих линий.

Рост суспензионной культуры клеток (так же как и каллусной ткани) высших растений оценивают по следующим параметрам или критериям роста: 1) сырая и сухая масса; 2) индекс роста; 3) число клеток в единице объема; 4) жизнеспо­собность клеток.



 

анализатор параметров тела