Шпаргалки для студентов

готовимся к сессии

  • Увеличить размер шрифта
  • Размер шрифта по умолчанию
  • Уменьшить размер шрифта

Шпаргалки по микробиологии. Часть 2 - Явления рестрикции и модификации.

Индекс материала
Шпаргалки по микробиологии. Часть 2
Мембранная структура бактериальных клеток
Взаимодействие микроорганизмов с высшими растениями.
Антибиотики. Природа действия
Типы микроскопии и использование.
Способы генетического обмена у бактерий.
Хемолитотрофы
Молочнокислое брожение
Получение накопительных культур.
Оперонный принцип организации генов у бактерий.
Органоиды движения. Типы движения.
Псевдомонады
Распространение в природе. Использование человеком.
Факторы физической природы.
Бактериофаги.
Бактериальная трансдукция.
Патогены высших животных
Анаэробное дыхание
Конкуренция микроорганизмов. Бактериоцины.
Формы и взаимодействия между микрорганизмами.
Явления рестрикции и модификации.
Фототрофные бактерии. Фотосинтетический аппарат.
Типы трансдукции
Спирохеты.
Биогеохимическая деятельность микроорганизмов.
Компетентность. Получение компетентных культур.
Рикеттсии и хламидии.
Все страницы




Явления рестрикции и модификации.

 

Явление рестрикции и модификации было подробно исследовано В. Арбером в конце 1960-х годов при изучении развития бактериофага λ в различных штаммах кишечной палочки.

Известно, что бактериофаги, как правило, проявляют специфичность в отношении хозяев. Это в первую очередь зависит от того, имеются или нет на бактериальных клетках рецепторы для адсорбции бактериофага.

Рассмотрим функционирование этой системы на примере бактериофага λ и клеток штамма E. coli K-12. Развитие фага приводит к эффективности посева, равной единице: каждая частица бактериофага заражает бактериальную клетку, репродуцируется в ней и дает потомство, фиксируемое визуально по наличию на газоне чувствительных бактерий зон лизиса или бляшек. Если фаголизатом, полученным после цикла развития фага на бактериях E. coli K-12, инфицировать бактерии E. coli штамма C, то эффективность посева будет значительно ниже (10–4–10–5). Следовательно, не каждая фаговая частица по каким-то причинам способна размножаться в клетках нового хозяина. Если же фаговые частицы,

образовавшиеся после цикла репродукции на клетках E. coli C, использовать для заражения такой же культуры (E. coli C), то размножение бактериофага вновь будет проходить нормально и эффективность посева составит единицу. Однако если перед заражением бактерий E. coli C фаг пропассировать на клетках E. coli K-12, то на штамме E. coli C он будет развиваться с низкой эффективностью.

Таким образом, при смене хозяина наблюдается значительное ограничение размножения фага, которое получило название рестрикции. Рестрикция обусловлена расщеплением инфицирующей ДНК фага под

действием фермента, специфичного для штамма-хозяина. Ферменты эти получили название рестрикционных эндонуклеаз или рестриктаз. Благодаря своему нуклеазному действию они препятствуют поддержанию чужеродной ДНК в бактериальной клетке.

Если фаг проделал полный цикл репродукции в новом хозяине (в нашем примере штамм E. coli C), то в дальнейшем в этом же хозяине он не подвергается ограничению, или рестрикции. Объяснить подобные факты можно следующим образом. В бактериальной клетке, кроме рестриктаз, синтезируются другие ферменты – метилазы, которые призваны защищать собственную ДНК от действия клеточных рестриктаз. Метилазы изменяют или модифицируют собственную ДНК путем метилирования или гликозилирования аденина либо цитозина. Этот процесс известен под названием модификации. ДНК бактериофага, прошедшего полный цикл развития в новом хозяине, под действием метилаз модифицируется таким же образом, как и ДНК клетки-хозяина. Она метилируется и приобретает свойства, защищающие ее от воздействия рестрикционных ферментов данного штамма бактерий.

Следовательно, работающая в клетках бактерий система рестрикции-модификации (система R-M) образована двумя специфическими для определенного штамма микроорганизма ферментами – ДНК-модифицирующим (аденин- или цитозинметилаза) и расщепляющим (рестриктаза). Эти ферменты узнают в ДНК одни и те же определенные короткие последовательности нуклеотидов – сайты. Метилаза, модифицируя определенные основания внутриклеточной ДНК, защищает ее от действия ре-

стриктазы, узнающей ту же нуклеотидную последовательность.

Системы рестрикции и модификации широко распространены среди бактерий и найдены практически у всех исследованных видов. Недавно рестриктазы обнаружены и у некоторых видов дрожжей. Из разных

штаммов микроорганизмов выделяют рестриктазы, различающиеся между собой характером действия на ДНК.

В научной литературе рестриктазы обозначаются буквой R. Название фермента складывается из первой буквы рода и двух первых букв вида бактерий, из которого был выделен фермент, например Bacillus subtilis – Bsu, Escherichia coli – Eco. Если же в определенном штамме имеется несколько систем рестрикции и модификации, то вводится дополнительное числовое обозначение. Ферменты систем рестрикции и модификации мо- гут кодироваться плазмидными и фаговыми генами, и тогда к названию

фермента добавляется название внехромосомного элемента.

Рестриктазы I типа являются сложными белками с тремя различными типами субъединиц (эндонуклеаза, метилаза, фермент узнавания). Для действия этих ферментов в качестве кофакторов требуются АТФ, S-аденозинмонофосфат и ионы Mg2+. Расщепление ДНК совмещено с гидролизом АТФ. Рестриктазы I типа узнают сайт рестрикции, но расщепляют последовательность ДНК на произвольном расстоянии от сайта узнавания. В результате образуются самые разнообразные фрагменты ДНК, или рестрикты. Такие рестриктазы невозможно использовать для решения генно-инженерных задач.

Системы рестрикции и модификации II типа представлены двумя отдельными белками (рестрикционная эндонуклеаза, модификационная метилаза). Рестриктазы II типа – относительно просто организованные белки, состоящие из двух субъединиц одного типа со сравнительно небольшой молекулярной массой. Для специфического действия этих ферментов нужны только ионы Mg2+. Рестриктазы II типа характеризуются тем, что у них сайты узнавания и места рестрикции совпадают. Обычно рестриктаза II типа узнает определенную последовательность ДНК и вызывает ее разрыв внутри этой последовательности. Сайты рестрикции рестриктаз II типа представлены симметричными при повороте

на 180 последовательностями – палиндромами. Рестриктазы II типа делятся на несколько классов в зависимости от размера сайта рестрикции и длины получаемых фрагментов ДНК. 1) мелкощепящие – сайт рестрикции представлен 4 п.н.; 2) среднещепящие – сайт рестрикции – 6–8 п.н.; 3) крупнощепящие – сайт рестрикции – 10–14 п.н.

Рестриктазы II типа делятся на две группы в зависимости от того, каким образом они расщепляют последовательность ДНК. Одни из них осуществляют прямой разрез ДНК (по оси симметрии). В результате образуются фрагменты ДНК с тупыми или ровными концами. эндонуклеаза BalI.

Рестриктазы, относящиеся ко второй группе, осуществляют ступенчатый разрез (на некотором расстоянии от оси симметрии). В результате этого в месте разреза образуются неровные, или липкие, концы. Примером таких рестриктаз является фермент EcoR1. Рестрикты, полученные после воздействия на разные молекулы ДНК определенной рестриктазы, имеют одинаковые липкие концы. Такие рестрикты могут объединяться друг с другом с образованием рекомбинантных молекул ДНК, что широко используется в генетической инженерии.

Рестриктазы III типа имеют некоторое сходство с рестриктазами I типа. Фермент состоит из двух различных субъединиц (эндонуклеаза, метилаза), и поэтому бифункционален, обладает как рестриктазной, так и метилазной активностью. Для проявления эндонуклеазной активности требуются только АТФ и ионы Mg2+. Расщепление ДНК не сопровождается гидролизом АТФ.

Ферментативная активность рестриктаз измеряется в единицах активности. Это такое количество фермента, необходимо для полного гидролиза за один час 1 мкг ДНК фага при оптимальных условиях.

  1. Выявление резервных веществ.

У многих бактерий, выращиваемых в определенных условиях, в результате обменных процессов в цитоплазме образуются отложения,которые называют включениями. Среди них – отложения жира, по-

ли-β-гидрооксимасляной кислоты, полифосфатов, полисахаридов, серы и различных кристаллов. Для выявления этих включений, которые сильно преломляют свет, применяется несколько методов.

Включения волютина хорошо выражены у Spirillum volutans, Bacillus subtilis, а также у возбудителей сибирской язвы и дифтерии. Гранулы волютина имеют относительно крупные размеры, окрашиваются

различными красителями, изменяя цвет последних. Например, при окрашивании метиленовым синим волютин окрашивается в яркокрасный цвет. Такое явление получило название метахромазии. Гра-

нулы волютина представлены полифосфатами – запасающимся веществом, которое служит источником фосфатных групп. Окраска гранул волютина по Нейссеру. Техника: 1. На фиксированный мазок наносят 2 – 3 капли раствора метиленового синего по Нейссеру и окрашивают в течение 1 – 2 мин. 2. Краситель сливают.3. Мазок обрабатывают раствором Люголя в течение 20 – 30 с.4. Не промывая препарат водой, мазок дополнительно окрашивают 2 – 3 мин 2 % раствором везувина.5. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют, используя иммерсионую систему. Цитоплазма окрашивается в желтый цвет, а гранулы волютина – в темно-синий