Шпаргалки для студентов

готовимся к сессии

  • Увеличить размер шрифта
  • Размер шрифта по умолчанию
  • Уменьшить размер шрифта

Шпаргалки по микробиологии. Часть 2 - Биогеохимическая деятельность микроорганизмов.

Индекс материала
Шпаргалки по микробиологии. Часть 2
Мембранная структура бактериальных клеток
Взаимодействие микроорганизмов с высшими растениями.
Антибиотики. Природа действия
Типы микроскопии и использование.
Способы генетического обмена у бактерий.
Хемолитотрофы
Молочнокислое брожение
Получение накопительных культур.
Оперонный принцип организации генов у бактерий.
Органоиды движения. Типы движения.
Псевдомонады
Распространение в природе. Использование человеком.
Факторы физической природы.
Бактериофаги.
Бактериальная трансдукция.
Патогены высших животных
Анаэробное дыхание
Конкуренция микроорганизмов. Бактериоцины.
Формы и взаимодействия между микрорганизмами.
Явления рестрикции и модификации.
Фототрофные бактерии. Фотосинтетический аппарат.
Типы трансдукции
Спирохеты.
Биогеохимическая деятельность микроорганизмов.
Компетентность. Получение компетентных культур.
Рикеттсии и хламидии.
Все страницы




Биогеохимическая деятельность микроорганизмов.

 

Круговороты веществ.

  1. Прото и сферопласты.

Кроме трех основных способов обмена генетической информацией, имеются и другие способы, которые еще недостаточно изучены и не так успешно применяются в лабораторной практике. Одним из таких способов обмена является слияние бактериальных протопластов или (и) сферопластов. Это так называемый искусственный обмен генетической информацией, так как здесь участвуют не интактные клетки, а протопласты или сферопласты. Исследователь должен сначала получить протопласты или сферопласты из клеток обоих родителей, а на следующем этапе смешать и индуцировать их слияние путем обработки полиэтиленгликолем либо другими агентами. Первичный продукт такого слия-

ния – клетка, объединяющая в себе геномы обоих родительских клеток. Слившиеся протопласты или сферопласты высевают на специальные среды, на которых создаются условия для регенерации их в морфологически полноценные клетки. В процессе последующей рекомбинации возникают стабильные рекомбинанты, совмещающие некоторые признаки обоих родительских штаммов.

Метод слияния протопластов или сферопластов пока успешно применяется только в отношении грамположительных бактерий. В последнее время разработаны условия для слияния сферопластов таких грамотрицательных бактерий, как Pseudomonas, Erwinia и др.

В отличие от конъюгации, трансформации и трансдукции, при которых ДНК передается от донора реципиенту, перенос генетической информации при слиянии протопластов или сферопластов не носит однонаправленного характера, а родительские вносят равноценный вклад в образование рекомбинантов.

Протопластами называют клетки округлой формы, полностью лишенные остатков клеточной стенки и окруженные только цитоплазматической мембраной. Их образование характерно чаще для грампол.Сферопласты отличаются от протопластов тем, что у них сохраняются остатки клеточной стенки, а образуются они преимущественно из клеток грамотрицательных бактерий.

В лабе: Фермент лизоцим действует на 1,4-гликозидные связи муреина. Антибиотики пенициллинового ряда и циклосерин оказывают действие только на растущие бактерии, нарушая синтез муреина клеточной стенкипрепятств. образованию пептидных связей.

Н-р: эндопептидазу, синтезируемую бактериями Escherichia coli. Этот фермент разрывает пептидную связь между D-аланином и мезодиаминопимелиновой кислотой.

Протопласты и сферопласты стабильно сохраняются в гипертонических или изотонических условиях.

В гипотонических условиях протопласты и сферопласты лопаются и образуют «тени».

В отличие от исходных клеток, на них не адсорбируются бактериофаги и бактериоцины. Кроме того, у протопластов и сферопластов отсутствуют мезосомы – производные цитоплазматической мембраны.

При снятии действующего на муреин фактора протопласты, как правило, отмирают, реже регенерируют клеточную стенку и возвращаются в исходное состояние, но могут превращаться в L-формы. Сферопласты ревертируют в норм.бакт. клетки, либо превращаются в L-формы, либо отмирают.

Бактерии, частично или полностью лишенные клеточной стенки, но сохранившие способность к развитию, принято называть L-формами.

L-формы образуются в результате несбалансированного роста нормальных бактериальных клеток в длину и толщину и поэтому плеоморфные. В отличие от протопластов и сферопластов, клетки L-форм имеют хорошо развитую систему внутрицитоплазматических мембран. L-формы обладают пониженным уровнем метаболической активности по сравнению с исходными бактериями. Они нечувствительны к любым агентам, действующим на клеточную стенку.

Культивировать L-формы можно только на специальных средах с высоким осмотическим давлением. У L-форм не функционируют нормальные механизмы клеточного деления. В основном они делятся с образованием элементарных тел, которые отпочковываются от поверхности клетки или от мембраны вакуоли. Нестабильные L-формы обладают элементами клеточной стенки и поэтому способны ревертировать в нормальные бактериальные клетки после исключения действия фактора, вызвавшего их образование. Стабильные L-формы полностью лишены ригидной клеточной стенки, что сближает их с протопластами.

3. Выделение ауксотрофных мутантов

Для любой мутации, связанной с потерей генетической функции, требуются такие методы выявления, которые позволили бы идентифицировать очень редко возникающие мутантные клетки на большом фоне немутантных. В эту группу входят ауксотрофные мутанты, мутанты с изменениями в сбраживании углеводов, морфологические и другие условно-летальные мутанты.

Для получения ауксотрофных мутантов проводят следующее:

1 Клетки бактериального штамма выращивают до середины логарифмической стадии роста (5х108 кл/мл). Культуру отмывают от питательной среды путем центрифугирования (10 мин при 5000 об/мин) и ресуспендируют в цитратном буфере рН 6,0 с нитрозогуанидином в определенной концентрации. Используемую концентрацию мутагена подбирают экспериментально с таким расчетом, чтобы выживаемость культуры не была ниже 50 – 10 %.

2. Клетки отмывают от буферной смеси путем центрифугирования, ресуспендируют в жидкой полноценной среде и инкубируют 18 – 20 часов при оптимальной для роста бактерий температуре.

3. Выросшую культуру осаждают, отмывают минимальной средой (свободной от факторов роста) и культивируют при аэрации в течение 3 часов.

4. К полученной культуре добавляют пенициллин (конечная концентрация – 2000 мкг/мл) и продолжают инкубировать еще 2 часа. При использовании пенициллиновой методики необходимо строгое соблюдение некоторых условий:

• обрабатываемая пенициллином популяция бактерий не должна содержать более 107 кл/мл. При использовании более густой суспензии, выделяющиеся в среду продукты лизиса клеток, погибших от пенициллина, будут служить источником ростовых веществ для ауксотрофных мутантов. В результате ауксотрофные клетки начнут делиться и также будут погибать при действии пенициллина. В суспензиях клеток меньшей плотности содержание продуктов лизиса недостаточно для обеспечения роста ауксотрофов;

• обработка популяции бактерий пенициллином не должна быть продолжительной, так как увеличением времени воздействия антибиотика нарастает количество продуктов лизиса убитых клеток. Обычно используют высокие концентрации при продолжительности воздействия не более двух часов;

• бактерии, выращенные в полноценной среде, перед обработкой пенициллином необходимо отмыть после центрифугирования минимальной средой и выдержать в ней в течение времени, достаточного для 4 – 5 генераций. Это необходимо для истощения эндогенных метаболитов, имеющихся в ауксотрофных клетках, чтобы предотвратить их деление в среде с антибиотиком.

5. Из взвеси клеток готовят ряд последовательных разведений в ф зиологическом растворе и по 0,1 мл из каждого разведения высевают на полноценную агаризованную среду. Чашки инкубируют 24 – 48 ч.

6. Выросшие на чашках колонии пересевают методом реплик на агаризованные полноценные и минимальные среды. Инкубируют 24 – 48 ч.

7. Анализируют рост каждого клона на полноценной и минимальной среде. Клоны, которые сформировались только на полноценной, а не на минимальной среде, считают потомством мутантных клеток.

8. Определяют потребности в факторах роста у выделенных ауксотрофных мутантов. Для этого перепечатывают клоны на минимальный агар с добавками аминокислот в различных комбинациях Определяют, при наличии каких наборов факторов роста растет данный мутант. Эти данные дают возможность сделать вывод о природе нарушения, вызванного мутацией. Также для характеристики мутаций проводят определение природы изменений в ДНК с анализом, например, обратных мутаций. Частота реверсии – важный параметр, который является мерой генетической стабильности мутации. Критерием, определяющим ценность мутации является и степень инактивации гена, в котором произошла мутация (полная утрата или частичное сохранение функции).